本发明提供了一种全人源抗CD15抗体,其重链可变区具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列,轻链可变区具有SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列,本抗体分子与细胞粘附分子(CD15抗原)特异性地结合,其亲和力大于10
1.一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体,其特征在于,所述的全人源抗体的重链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:5所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:6所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:7所示的CDR3;所述的全人源抗体的轻链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:8所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:9所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:10所示的CDR3。
2.根据权利要求1的全人源抗体,其特征在于,所述的全人源抗体的重链可变区具有SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的全人源抗体,其特征在于,所述的全人源抗体的轻链可变区具有SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。
4.一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体,其特征在于,所述的全人源抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有SEQxa0IDxa0NO:2和SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。
5.一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体片段,其特征在于,所述的全人源抗体片段的重链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:5所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:6所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:7所示的CDR3;所述全人源抗体片段的轻链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:8所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:9所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:10所示的CDR3;所述的抗体片段包括单链抗体(scFv)、Fab、Fab"、F(ab")_2xa0的形式。
6.一种特异性结合CD15抗原的活性蛋白,其特征在于,所述的活性蛋白是带有小分子标记的权利要求1~4任意一项所述抗体或者权利要求5所述抗体片段。技术领域
本发明涉及抗体技术领域,尤其涉及特异性结合CD15的全人源抗体及应用。
背景技术
CD15(也称Sialylxa0lewisxa0x)主要分布在白细胞、血管内皮细胞和某些肿瘤表面。CD15是一种细胞粘附分子,因其对霍奇金淋巴瘤(HD)中的R-S细胞具有良好的标记作用,被认为是HD的重要标志物。除HD的鉴别诊断外,对胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤CD15的表达研究发现,CD15表达随癌细胞分化程度下降、淋巴结转移和临床分期增高而明显增高。认为CD15的表达是判断肿瘤的发展、预测淋巴结转移和预后的良好指标(Brooksxa0SA,Leathemxa0AJC.expressionxa0ofxa0thexa0CD15xa0antigen(Lewisxa0x)inxa0breastxa0cancer.Histochemxa0J,1995;27:689-693)。免疫电镜观察显示,CD15抗原主要分布于大肠癌细胞浆的界膜、内质网、高尔基体及近细胞核膜处,CD15可能是通过对所结合的铺基构型改变影响和参与肿瘤的形成和转移过程。此外,CD15是白细胞的标记抗体,在淋巴瘤的诊断中有一定的价值。肿瘤抗原特异的免疫治疗可以分为抗体抗肿瘤免疫治疗和T细胞抗肿瘤免疫治疗。由于抗体自身的限制,不能通过细胞膜进入胞内,所以抗体的抗肿瘤免疫反应均作用于细胞表面表达的肿瘤抗原,比如靶向作用于AML细胞表面抗原CD13、CD15、CD33、CD155和CD66的抗体治疗。例如脓疱型银屑病(Pustularxa0psoriasis,PP)是一种以炎症为主的亚型银屑病,临床特点为全身或局部反复发生无菌性脓疱。陈胜平等就有报道抗人黏附分子CD15、CD11b或ICAM-1单克隆抗体的研制及应用将为PP的治疗提供一条新途径(陈胜平,张国威,何威,刘向农.脓疱型银屑病患者外周血中性粒细胞及皮损部位黏附分子的表达.中国全科医学,2006;9卷8期.)。本领域迫切需要具有高亲和力的全人源的抗CD15抗体,用于诊断和治疗CD15相关疾病如胃癌、白血病、类风湿关节炎、银屑病等。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性结合CD15抗原的抗体,尤其是全人源单克隆抗体,以满足临床上诊断和/或治疗CD15相关疾病的需要。本发明的第一方面,提供了一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体,该全人源抗体的重链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:5所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:6所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:7所示的CDR3。在优选的方案中,该全人源抗体的重链可变区具有SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列。本发明的第二方面,提供了一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体,该全人源抗体的轻链可变区包含如下的互补决定区:SEQxa0IDxa0NO:8所示的CDR1,SEQxa0IDxa0NO:9所示的CDR2,SEQxa0IDxa0NO:10所示的CDR3。在优选的方案中,该人源抗体的轻链可变区具有SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。本发明的第三方面,提供了一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体,该全人源抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有SEQxa0IDxa0NO:2和SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。本发明的第四方面,提供了一种特异性结合CD15抗原的全人源抗体片段,该全人源抗体片段包括SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列和/或SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。该全人源抗体片段包括单链抗体(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)₂等形式。本发明的第五方面,提供了一种特异性结合CD15抗原的融合蛋白或多肽,该融合蛋白或多肽包括SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列和/或SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。本发明的第六方面,提供了一种小分子标记的活性蛋白,该活性蛋白包含SEQxa0IDxa0NO:2所示的氨基酸序列和/或SEQxa0IDxa0NO:4所示的氨基酸序列。本发明的第七方面,提供了一种编码特异性结合CD15抗原的全人源抗体的重链可变区的DNA序列,该DNA序列编码SEQxa0IDxa0NO:2所示的多肽。在一个优选的方案中,该DNA序列如SEQxa0IDxa0NO:1所示。本发明的第八方面,提供了一种编码特异性结合CD15抗原的全人源抗体的轻链可变区的DNA序列,该DNA序列编码SEQxa0IDxa0NO:4所示的多肽。在一个优选的方案中,该DNA序列如SEQxa0IDxa0NO:3所示。本发明的第九方面,提供了本发明的特异性结合CD15抗原的全人源抗体、抗体片段、融合蛋白、小分子标记活性蛋白在治疗或诊断淋巴细胞瘤、艾滋病、类风湿性关节炎、同种异体器官移植排斥反应等疾病中的应用。本发明的第十方面,提供了一种药物组合物,包含安全有效量的本发明的特异性结合CD15抗原的全人源抗体、抗体片段、融合蛋白、小分子标记活性蛋白和药学上可以接受的载体。
附图说明
图1:实施例4制备的14株抗CD15抗体阳性克隆菌的FLISA活性检测结果。包被抗原为100ul的CD15抗原(1ug/ml),空心柱状体为加入100ul阳性克隆菌提取的抗CD15抗体的试验组,带斜线的柱状体为加入100ul的BSA(100ug/ml)的对照组。其中活性最高的阳性克隆菌是第10株,编号为3-17^#。图2:3-17^#菌产生的抗CD15抗体的二倍稀释法检测结果。
具体实施方式
本文所用的术语“抗体”是能够通过至少一个抗原识别位点,和靶分子(包括糖、多聚核酸、脂类、多肽等)特异结合的免疫球蛋白。完整的抗体是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键和重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区和重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区和重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链的重链的可变区之间形成界面。本文所用的术语“单克隆抗体”是指包含参与选择性结合某一抗原氨基酸结构(自然或者经改建)的同一抗体群。单克隆抗体具有高度特异性,针对某一单一抗原位点。本文所用的术语“可变区”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包括四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR区相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIHxa0Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类,主要有5类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些还可进一步分为亚类(同类型),如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白重链恒定区分别称为α、β、ε、μ、γ。不同免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。本文所用的“全人源抗体”是指抗体基因来源人类的抗体。本文中,所谓“抗体”不但包括完整的多克隆或者单克隆抗体,也包括各种抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv),单链抗体(ScFv),二体,由抗体片段形成的多特异性抗体,含有抗体片段的融合蛋白,以及任何经过改造但包含所需特异性识别位点的免疫球蛋白分子。抗体的来源或者制备方法并不受限制,例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等。适宜的“标记”包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。下面将结合实施例进一步详细地描述本发明,然而应该理解,列举这些实施例只是为了说明本发明,而不是用来限制本发明。下列实施例中未特别指明的浓度为质量百分比浓度;未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,《分子克隆实验指南》(Newxa0York:Coldxa0Springxa0Harborxa0LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.人源抗体库的构建全人源单链抗体(scFv)库的构建是采用He等人[Hexa0etxa0al.Methodsxa0Molxa0Biol.2004;248:177-189]报道的方法构建,从83例肿瘤患者的外周血液提取mRNA,采用如下引物,用RT-PCR的方法体外扩增重链和轻链的可变区基因,用重叠延伸PCR(Overlap-extensionxa0PCR)的方法将两段基因通过一段linker序列组装成完整的抗体cDNA库序列。重链引物:(1)HuVH/B:5’-CAGGT(c/g)CAGCTGG(t/a)G(c/g)AGTC(t/c)GG-3’(2)HuJH/F:5’-TGAGGAGACGGTGACCA(t/g)GGTCCC-3’连接序列引物(3)linker/B:5’-GGGACC(a/c)TGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCTCTGG-3’(4)linker/F:5’-TTGCCACCGCCAGAACC-3’κ轻链引物(5)HuVκ/B:5’-GGTTCTGGCGGTGGCAAAGA(a/c)AT(c/t)(g/a)TG(a/c)TGAC(c/g/t)CAGTCTCC-3’(6)HuCκ/F:5’-TGAGGAGACGGTGACCA(t/g)GGTCCC-3’λ轻链引物(7)HuV/B:5’-GGTTCTGGCGGTGGCAAACAG(t/g)CTGTGCTGACTCAGCC(g/c)CC-3’(8)HuC/F:5’-AGATTCTGTAGGGGCCACTGTC-3’利用一对引物5’-ACCACCATGGAGGTSCASCTCGAGSAGTCTGG-3’和5’-GCGAATTCTTAGCAGCCACCCAGGTGATGGTGATGGTGATGAGATGGTGCAGCCACAG-3’在抗体cDNA库的两侧分别引入Ncoxa0I和EcoRxa0I两个酶切位点。将scFv的cDNA文库用Ncoxa0I和EcoRxa0I酶切,pET22b载体用Ncoxa0I和EcoRxa0I酶切,分别回收酶切后的片段,酶切后的scFv文库与载体连接后转化Rosetta感受态,涂布LB固体平板,挑取了1500株单菌落,用滤纸粘附克隆显蓝反应法(colonyxa0filterxa0method)对克隆子进行功能筛选。实施例2.滤纸粘附克隆显蓝反应法用一张甲醇处理过的PVDF膜影印平板上长出的菌落,之后菌落一面朝上平铺于含有1mMxa0IPTG和50ug/mlxa0ofxa0ampicillin的琼脂平板上,30°C静置培养4个小时。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤缓冲液洗涤板孔3次,每次5分钟,然后用含有0.05%Tweenxa020和1%BSA的PBS室温封闭1小时。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤缓冲液洗涤板孔3次,每次5分钟,将Anti-Hisxa0HRP(Sigma产品)用含0.05%Tweenxa020和1%BSA的PBS按1∶5000稀释成工作液后与PVDF膜孵育两个小时,用含0.05%Tweenxa020的PBS缓冲液洗涤3次,再用化学发光试剂(Pierce公司产品)对膜进行曝光,得到了420株阳性菌落。实施例3.抗原抗体作用的检测(化学发光法)用80ulxa0PBS将CD15抗原(产品名称:Sialylxa0Lewisxa0x唾液酸化路易斯x抗原;Calbiochem,产品货号:565950)稀释成10ug/ml的浓度,包被在甲醇处理过的PVDF膜上,4°C孵育过夜。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤三次,每次5分钟。用Superblockxa0bufferxa0inxa0PBS(Thermo公司)进行室温封闭1小时。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤三次,每次5分钟。将抽提好的420株阳性菌落的周质蛋白分别点样在PVDF膜上,与抗原进行特异作用,室温孵育1小时。再用0.05%Tweenxa020的PBS洗涤三次,每次5分钟。将anti-Hisxa0HRP(Sigmaxa0aldrich)用含0.05%Tweenxa020和1%BSA的PBS稀释8000倍,均匀地铺在膜上,室温轻轻震荡2个小时。再0.05%Tween20的PBS洗涤三次,每次5分钟。用化学发光试剂Supersignalxa0westxa0Pico(Pierce公司)室温孵育5分钟,在化学发光成像系统Chemidoc(Bio-rad公司)的暗室曝光,筛选出约14株与CD15抗原特异结合的且斑点颜色相对较深的阳性克隆菌。实施例4.抗体的表达及纯化将上步筛选到的14株阳性克隆菌落用含0.5%的葡萄糖的LB培养基分别37°C培养过夜,其中加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素和64ug/ml的氯霉素,次日早上加入终浓度为1mM的IPTG,继续25-30°C培养4个小时后5000g离心5分钟。按照每克菌重对应5ml的比例加入洗涤缓冲液(300mMxa0NaCl,50mMNaH₂PO₄和10mM咪唑,PH8.0),冰浴上超声波破碎细胞(超声4s间隔5s,99个循环),之后12000g离心40分钟。取上清液与之前用洗涤缓冲液平衡的1mlNi-NTA亲和填料混合,4°C震荡1个小时加载在纯化柱上,30个柱体积的洗涤缓冲液洗涤。用1ml的洗脱缓冲液(300mMxa0NaCl,50mMxa0NaH₂PO₄和250mM咪唑)洗脱,收取目标洗脱液。对收集的样品进行常规的ELISA实验,结果见图1,选择OD450吸收值最大的一株菌:3-17^#菌。3-17^#菌分泌并纯化后的抗体样品经SDS-PAGE电泳后,用Qualityxa0One分析软件得知其纯度大于80%,达到ELISA亲和力检测法的基本纯度,样品的浓度采用Bradford方法测定,为320ug/ml。实施例5.ELISA检测抗原抗体的亲和力用100ul的1ug/ml的CD15抗原包被酶标板检测孔,4°C孵育过夜。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤缓冲液洗涤板孔3次,每次5分钟,之后用含有0.05%Tween20和1%BSA的PBS室温封闭1小时。按二倍稀释法将3-17^#菌产生并经亲和纯化后的抗体稀释为浓度梯度样品,分别加入100ul稀释样品到上述包被有抗原的孔中,阴性对照采用没有转化质粒的Rosetta菌提取的蛋白,37°C孵育1个小时。用含0.05%Tweenxa020的PBS洗涤缓冲液洗涤板孔3次,每次5分钟。将Anti-HisHRP(Sigma产品)用含0.05%Tweenxa020和1%BSA的PBS按1∶5000稀释成工作液后加在之前孵育样品的孔中孵育两个小时,用含0.05%Tweenxa020的PBS缓冲液洗涤3次。在孔中加入TMB溶液,37°C孵育10分钟,加入50ulxa01Nxa0HCl终止显色反应,用ELISA酶标仪于450nm波长读数。根据公式,计算抗体与抗原的亲和力为2.0×10^-7M,二倍稀释亲和结果见图2。实施例6.CD15单克隆抗体基因的测序对筛选到的3-17#菌产生的单链抗体基因进行测序,结果在序列表中。其中SEQxa0IDxa0NO:1和SEQxa0IDxa0NO:3是本发明获得的高活性的单链抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA序列,SEQxa0IDxa0NO:2和SEQxa0IDxa0NO:4则是根据上述DNA序列推测出的氨基酸序列。SEQxa0IDxa0NO:5~7是推测出的重链可变区的互补决定区CDR1~CDR3;SEQxa0IDxa0NO:8~10是推测出的轻链可变区的互补决定区CDR1~CDR3。上述实施例只是为了说明本发明,并非将本发明限定于上述范围。上述实施例可能作很多变动,在阅读了本发明公开的内容之后,本领域技术人员可以对本发明做出各种改动和修改,这些等价形式同样落入本发明权利要求书的保护范围之内。序列表<110>中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所<120>一种特异性结合CD15的全人源抗体及应用<160>20<170>PatentInxa0versionxa03.1<210>1<211>381<212>DNA<213>智人(Homoxa0sapiens)<220><221>misc_feature<222>(1)..(381)<223>重链可变区<400>1gaggtccagcxa0tcgagcagtcxa0tggagcagagxa0gtgaaaaagcxa0ccggggagtcxa0tctgaagatcxa0xa0xa0xa060tcctgtaaggxa0gttctggataxa0cagctttaccxa0taccactggaxa0tcggctgggtxa0gcaccagc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